一、Western 及 IP 裂解液的使用方法

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

• 樣本收集：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求收集細(xì)胞或組織樣本。對(duì)于細(xì)胞樣本，貼壁細(xì)胞需先用 PBS 緩沖液輕柔洗滌 2 - 3 次，去除培養(yǎng)基殘留；懸浮細(xì)胞則通過離心（通常 500 - 1000 rpm，3 - 5 分鐘）收集，并用 PBS 重懸洗滌。組織樣本需在預(yù)冷的生理鹽水中清洗，去除血液等雜質(zhì)，并用干凈的剪刀或刀片將其剪碎成小塊。

• 裂解液準(zhǔn)備：從低溫儲(chǔ)存環(huán)境（-20℃或 4℃，根據(jù)產(chǎn)品說明）取出裂解液，平衡至室溫。若裂解液中蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等為單獨(dú)包裝，需在使用前按照說明準(zhǔn)確添加到裂解液中，并充分混勻。

2. 樣本裂解

• 細(xì)胞樣本裂解：對(duì)于貼壁細(xì)胞，可直接在培養(yǎng)板中加入適量裂解液（通常每 1×10?個(gè)細(xì)胞加入 100 - 200 μL 裂解液），輕輕搖晃培養(yǎng)板使裂解液均勻覆蓋細(xì)胞表面，然后置于冰上，通過溫和振蕩（如渦旋振蕩器，低速振蕩 1 - 2 分鐘）或超聲處理（30 秒超聲，間隔 30 秒，重復(fù) 3 - 5 次，超聲功率需根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整）進(jìn)行裂解。懸浮細(xì)胞則需先離心去除 PBS，再加入裂解液，同樣在冰上進(jìn)行振蕩或超聲處理。

• 組織樣本裂解：將剪碎的組織樣本轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的勻漿器或離心管中，按照每 100 mg 組織加入 500 - 1000 μL 裂解液的比例添加裂解液。先使用機(jī)械勻漿器進(jìn)行初步勻漿，使組織破碎，然后結(jié)合超聲處理進(jìn)一步裂解細(xì)胞，確保蛋白質(zhì)充分釋放。

3. 蛋白質(zhì)提取

• 靜置與離心：樣本裂解完成后，將其置于冰上靜置 5 - 10 分鐘，使裂解更充分。隨后，將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，在 4℃條件下，以 12000 - 15000 rpm 離心 10 - 15 分鐘，使細(xì)胞碎片、不溶性物質(zhì)沉淀于管底，而上清液即為含有蛋白質(zhì)的裂解產(chǎn)物。

• 收集上清：小心吸取上清液至新的離心管中，避免吸入沉淀。若后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)濃度要求較高，可對(duì)上清液進(jìn)行適當(dāng)濃縮處理，如使用超濾管進(jìn)行濃縮。

二、使用 Western 及 IP 裂解液的注意事項(xiàng)

1. 裂解液儲(chǔ)存與保質(zhì)期

• 儲(chǔ)存條件：裂解液應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進(jìn)行儲(chǔ)存，多數(shù)需在 - 20℃低溫保存，避免反復(fù)凍融，因?yàn)槎啻蝺鋈诳赡軐?dǎo)致蛋白酶抑制劑等成分失活，影響裂解效果。若裂解液含有對(duì)溫度敏感的特殊成分，可能需要在 4℃保存。

• 保質(zhì)期檢查：使用前需檢查裂解液的保質(zhì)期，過期的裂解液可能因成分降解而無法有效裂解細(xì)胞或保護(hù)蛋白質(zhì)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若裂解液出現(xiàn)渾濁、沉淀或顏色異常等情況，應(yīng)避免使用。

2. 操作過程中的細(xì)節(jié)把控

• 低溫操作：整個(gè)樣本裂解和處理過程應(yīng)盡量在冰上或 4℃環(huán)境中進(jìn)行，以降低細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性，減少蛋白質(zhì)的降解。特別是對(duì)于一些不穩(wěn)定或易降解的蛋白質(zhì)，低溫操作尤為重要。

• 避免交叉污染：使用無菌的移液器槍頭、離心管等實(shí)驗(yàn)器具，避免不同樣本之間的交叉污染。同時(shí)，在添加裂解液、吸取上清等操作時(shí)，要小心謹(jǐn)慎，防止液體濺出污染其他樣本或?qū)嶒?yàn)環(huán)境。

• 裂解條件優(yōu)化：不同的細(xì)胞類型和組織樣本對(duì)裂解條件的要求可能不同，需根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化裂解時(shí)間、超聲功率、振蕩強(qiáng)度等參數(shù)。例如，對(duì)于一些細(xì)胞壁較厚的植物細(xì)胞或堅(jiān)韌的組織樣本，可能需要適當(dāng)延長裂解時(shí)間或提高超聲功率，但也要避免過度裂解導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞。

3. 與后續(xù)實(shí)驗(yàn)的兼容性

• 成分兼容性：確保裂解液中的成分不會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。例如，若后續(xù)要進(jìn)行蛋白質(zhì)純化（如親和層析、離子交換層析），裂解液中的高濃度鹽、去垢劑等成分可能影響純化效果，需進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐肝?、稀釋或更換緩沖液等處理。若進(jìn)行質(zhì)譜分析，需注意裂解液中的某些添加劑可能會(huì)影響質(zhì)譜檢測(cè)，應(yīng)選擇質(zhì)譜兼容的裂解液或進(jìn)行樣品預(yù)處理。

• 實(shí)驗(yàn)體系匹配：根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的裂解液。若進(jìn)行 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，需保證裂解液能夠使蛋白質(zhì)充分變性；若進(jìn)行 IP 實(shí)驗(yàn)，則要選擇能夠保持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的溫和型裂解液，以確保蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用不被破壞。